Isabel nunca gozó de buena salud. A raíz de los acontecimientos familiares sucedidos después de la conquista de Granada su sanidad comenzó a declinar. Su última marcha por el territorio español comienza en Sevilla en 1502 y termina en Medina del campo en noviembre de 1503. El 21-X-1504 Isabel dicta su testamento. Encarga a su confesor, fray Hernando de Talavera que investigue en todo el reino, villa por villa, convento por convento obispado por obispado, si quedan todavía descargos por hacer, o reclamos por atender. El 26 de noviembre al mediodía y a los cincuenta y tres años de edad, faltando poco para que cumpliera 30 años de reinado, entrega su alma Isabel la Católica. Su esposo Fernando dirá que había cambiado su reino por otro mejor, y el cronista Pedro Mártir de Anglería decía: 

«se me cae la mano de dolor... exhaló la Reina su espíritu, aquella su alma grande, insigne excelente en sus obras. El mundo se queda sin la mejor de sus prendas.»